在与绿魔的战斗后，蜘蛛侠帕克（托比马奎尔饰）不情愿地打断了他唯一的爱人玛丽（克尔斯滕邓斯特饰），因为蜘蛛侠的身份将为他服务，并且他的家人处于极大的危险之中，帕克决定采取蜘蛛侠独立承担责任。帕克一直忙于草率的挑战：学习如何灵活使用他的超能力；隐藏自己，在超级英雄和普通大学生的双重身份下小心翼翼地生活，等等。帕克越来越难以从玛丽身边解脱出来，但作为蜘蛛侠，他却无法和玛丽在一起。知己哈利因为误会一直反对蜘蛛侠；他唯一的亲戚阿姨对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。与此同时，一个新的挑战出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在各种压力下承担了蜘蛛侠的使命。
